豬圓環(huán)病毒實(shí)時熒光PCR檢測試劑盒
本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時熒光PCR技術(shù)，是針對豬瘟病毒設(shè)計(jì)的檢測體系，用于疑似感染動物血清或組織等樣本的檢測。
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒
英文名稱：Classical Swine Fever Virus Fluorescent PCR test kit
【試劑盒組成】
| 組成成份（25Tests/kit） | 規(guī)格 |
| 核酸擴(kuò)增試劑 | |
| RT-PCR反應(yīng)液 | 526.5µl×1管 |
| Taq酶(5U/µl) | 8.5µl×1管 |
| PCR enhancer | 5.5µl×1管 |
| 對照品 | |
| 陰性對照 | 25µl×1管 |
| 陽性對照 | 25µl×1管 |
注：不同批號的試劑組份不可混用。
【儲存條件及有效期】
本試劑盒貯存于-20℃的條件下有效期為6個月。
【生產(chǎn)日期及批號】
詳見包裝袋和外包裝盒。
【適用儀器(熒光PCR檢測儀)】
Ø ABI公司Prism7000、7300、7500系列
Ø RotorGene系列
Ø Bio-Rad公司的iCycler系列
【自備試劑】
核酸提取試劑。
【樣本采集、存放及運(yùn)輸】
1．樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集。
2．存放：分離后的血清或者血漿樣本在2℃—8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（最多凍融3次）。
3．運(yùn)輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
【檢驗(yàn)方法】
1．樣本處理：
用戶可采用病毒RNA提取試劑盒提取RNA用于檢測或保存于-20℃（-80℃更佳）以待檢測。說明：陽性對照及陰性對照無需提取，直接上樣。
2．擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）：
從試劑盒中取出RT-PCR 反應(yīng)液、Taq酶及PCR Enhancer，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心10秒。設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為n（n = 樣本數(shù) + 1管陰性對照 + 1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
| 試劑 | RT-PCR反應(yīng)液 | Taq酶 | PCR enchancer |
| 用量 | 19.5 µl | 0.3µl | 0.2 µl |
計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混合均勻，2000rpm離心10秒，向設(shè)定的n個PCR反應(yīng)管中分別加入20 µl，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
1．加樣（樣本處理區(qū)）：
向所設(shè)定的n個PCR 反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA、陰性對照和陽性對照各5µl，蓋緊管蓋，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。將PCR反應(yīng)管排好放入PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。
2．PCR擴(kuò)增（檢測區(qū)）
4.1 循環(huán)條件設(shè)置
50℃：10 min；
95℃：3 min；
95℃：10sec, 60℃: 1min 40個循環(huán)。
熒光信號收集設(shè)在60℃。反應(yīng)體系設(shè)為25ul。
4.2 儀器檢測通道選擇
待測熒光為FAM熒光素，熒光PCR檢測儀熒光信號收集設(shè)定為FAM熒光素。
3．結(jié)果分析條件設(shè)定：
5.1 閾值(threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
5.2 基線（baseline）應(yīng)選擇該次實(shí)驗(yàn)指數(shù)擴(kuò)增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點(diǎn)（循環(huán)數(shù)）應(yīng)避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點(diǎn)（循環(huán)數(shù)）應(yīng)比最早出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的樣本Ct值減少1-2個循環(huán)。
注：具體設(shè)置方法請參照各儀器使用說明書。
4．質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：
陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；
陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于32.0。
否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。
1．結(jié)果判斷：
Ø Ct值無讀數(shù)的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結(jié)果Ct值＜40.0為陽性，否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項(xiàng)】
1. 有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實(shí)驗(yàn)請嚴(yán)格分區(qū)操作：
第一區(qū)：PCR前準(zhǔn)備區(qū)——準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑；
第二區(qū)：樣本處理區(qū)——待測樣本和對照品處理；
第三區(qū)：檢測區(qū)——PCR擴(kuò)增檢測。
4. 各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，避免污染，實(shí)驗(yàn)后即請清潔工作臺。
5. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)扣蓋或裝入密實(shí)袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。
8. 加樣時應(yīng)使樣品完全落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。
9. 擴(kuò)增完畢立即取出反應(yīng)管，密封在專用塑料袋內(nèi)，丟棄于指定地點(diǎn)。
10. 反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。
11. 實(shí)驗(yàn)中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
12. 工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒
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