土霉素酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)
一、藥物概述及檢測(cè)原理
歐盟第675/92號(hào)令中初步規(guī)定在肌肉及牛奶中的四環(huán)素族化合物的總量不得超過(guò)100ppb，在腎臟，肝臟及雞蛋中分別不得超過(guò)600 ppb，300 ppb及200ppb。
本公司的土霉素酶聯(lián)免疫試劑盒使用生物技術(shù)開(kāi)發(fā)，具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)。
本試劑盒利用土霉素抗體與土霉素可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和土霉素抗體，樣本土霉素藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競(jìng)爭(zhēng)土霉素抗體，最后加入底物催化顯色。此時(shí)顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）中土霉素藥物的含量成反比。
二、試劑盒內(nèi)包含組分：
v 10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液：0 ppb、4ppb、12 ppb、36 ppb、108 ppb，0.5mL/瓶。
v 96孔酶標(biāo)板：1塊
v 土霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）
v 酶標(biāo)二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）
v 20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
v 20×濃縮復(fù)溶液：1瓶（10 mL/瓶）
v 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）
v 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
v 終止液：1瓶（7mL）
v 說(shuō)明書(shū)
v 蓋板膜
三、用戶需要自備的設(shè)備和試劑
儀器：
v 酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm、630 nm）
v 電子天平（精度：0.01 g）
v 離心機(jī)（4000 g及以上）
v 生化培養(yǎng)箱（可調(diào)25℃、37℃、60℃）
v 旋渦振蕩器
v 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
v 計(jì)時(shí)器
試劑：（試劑均為分析純）
v 去離子水
四、試劑盒特異性
試劑盒與其他藥物的交叉反應(yīng)率：
v 土霉素…………………………100%
v 金霉素…………………………240%
v 四環(huán)素…………………………200%
v 強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）……………………20%
五、樣本檢測(cè)步驟
1. 工作液準(zhǔn)備
v 復(fù)溶工作液：取1份20×濃縮復(fù)溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
v 1 M鹽酸溶液：量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。
2. 樣品前處理
組織樣本（稀釋倍數(shù)：12）
Ø 準(zhǔn)確稱取1±0.01 g均質(zhì)后的組織樣品于10 mL離心管中；
Ø 加入5 mL去離子水，劇烈渦動(dòng)2min；
Ø 4000 g以上，離心10 min；
Ø 取500ul上清液加入500ul復(fù)溶工作液（見(jiàn)5.1）中，渦動(dòng)10min；
Ø 取50ul進(jìn)行檢測(cè)。
蜂蜜樣本（稀釋倍數(shù)：10）
Ø 精確稱取1±0.01g蜂蜜樣品于10mL離心管中；
Ø 加入2mL去離子水，充分渦動(dòng)1 min溶解分散；
Ø 取100ul溶解液加入400ul復(fù)溶工作液中，渦動(dòng)1 0S混勻；
Ø 立即取50ul進(jìn)行檢測(cè)。
液態(tài)奶樣本方法一（稀釋倍數(shù)：10）（同卡那霉素液態(tài)奶方法一致）
Ø 將采樣好的液態(tài)奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
Ø 加入50μL 1M鹽酸（見(jiàn)5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
Ø 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min；
Ø 取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到最上層的奶油），再加入450μL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動(dòng)儀渦動(dòng)30s）；
Ø 取50 μL液體進(jìn)行分析。
液態(tài)奶樣本方法二（稀釋倍數(shù)：40）（同卡那霉素液態(tài)奶方法一致）
Ø 精確量取50ul液態(tài)奶樣品于1950ul復(fù)溶工作液中；
Ø 充分渦動(dòng)1 min混勻；
Ø 立即取50ul進(jìn)行檢測(cè)。
飼料（牛飼料、豬飼料）（稀釋系數(shù)：200 ）
Ø 準(zhǔn)確稱取 1±0.01 g 飼料樣品于 50mL 離心管中；
Ø 加入 5 mL 去離子水，充分渦動(dòng) 2min 至飼料*分散；
Ø 4000 g 以上，離心 10 min；
Ø 取40 μL上清液于新的離心管中，加入1560μL 復(fù)溶工作液 ，充分渦動(dòng) 30 s；
Ø 立即取 50μL 進(jìn)行檢測(cè)。
3. 檢測(cè)
Ø 準(zhǔn)備：將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，為減小檢測(cè)值波動(dòng)建議做雙孔平行實(shí)驗(yàn)（每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)兩孔），未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；
Ø 標(biāo)準(zhǔn)品工作液配制：分別取5個(gè)2ml離心管，標(biāo)記為0、0.4、1.2、3.6、10.8ppb；于每個(gè)管中加入900ul復(fù)溶工作液，于對(duì)應(yīng)管中加入100ul10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（0—0、0.4—4、1.2—12、3.6—36、10.8—108）；
Ø 加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗體工作液；
Ø 孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)30 min；
Ø 洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開(kāi)蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍干；
Ø 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；
Ø 孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min；
Ø 終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍(lán)變黃表明終止成功。
Ø 讀數(shù)：終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長(zhǎng)讀取酶標(biāo)板吸光度值。
4. 計(jì)算結(jié)果
Ø 設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標(biāo)準(zhǔn)（濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比：
Ø 使用半對(duì)數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Ø 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可得出樣品對(duì)應(yīng)的濃度，最后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測(cè)物含量。
六、試劑盒參數(shù)
Ø 試劑盒靈敏度：0.4 ppb；
Ø 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.4 ppb-10.8ppb；
Ø 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%；
Ø 板間變異系數(shù)：<15%；
Ø B0吸光度最佳值：>0.8；
Ø 回收率：90%±15%
Ø 樣品最低檢測(cè)限：
組織……………………………約12ppb
蜂蜜……………………………約20ppb
液態(tài)奶樣本方法一……………約20ppb
液態(tài)奶樣本方法二……………約40ppb
飼料……………………………約600ppb
注：ppb=ng/mL或ng/g。
七、分析限制
本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，建議使用儀器方法開(kāi)展確證實(shí)驗(yàn)（如GC/MS、LC-MS/MS等）。
八、試劑盒貯存條件
Ø 試劑盒最佳貯存溫度為2-8℃，切勿凍存。
Ø 未使用完的酶標(biāo)板須密封保存2-8℃的環(huán)境中。
九、注意事項(xiàng)
Ø 使用試劑盒前，請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。
Ø 試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組份置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。
Ø 試劑使用前需搖勻，混合時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。
Ø 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測(cè)過(guò)程中所用槍頭不得重復(fù)使用。
Ø 請(qǐng)勿使用過(guò)期試劑盒，不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用。
Ø 樣品處理完畢后請(qǐng)立即分析，否則可能影響檢測(cè)結(jié)果。
Ø 底物A液、底物B液均為無(wú)色透明液體，若在使用前已變成藍(lán)色，或混合后立即變藍(lán)，說(shuō)明試劑已污染或變質(zhì)。
Ø 加樣過(guò)程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應(yīng)時(shí)間差對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。
Ø 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請(qǐng)立即用大量清水沖洗。若不慎入眼，請(qǐng)?jiān)?清洗后去醫(yī)院檢查。
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